IPS诱导肠类器官的培养过程分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层的分化及中/后肠的模式化诱导、以及类器官的培养。本文将重点介绍第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制：

• （1）将hPSC Medium Supplement在2-8℃下解冻，解冻后轻轻摇动混匀，按需分装，立即使用或存于-20~-80℃，避免反复冻融。
• （2）按1:50的比例将hPSC Medium Supplement（10mL）加入hPSC Medium Basal Medium（500mL）中，混合均匀，即可得人多能干细胞培养基（abs9403）。注意：混合后的人多能干细胞培养基可在2-8℃稳定储存2-3周，不建议使用超过3周的培养基。
• （3）试剂平衡：实验前，将人多能干细胞培养基放置于室温下避光平衡；PBS和消化液等需加热至37℃，注意培养基中含有因子，无法在37℃水浴加热。

二、操作方法

注：以下步骤需在无菌条件下进行。

1. hPSC细胞复苏

• 1.1 基质胶包被培养板：取用6孔或12孔板，每孔加入1mL或0.5mL基质胶（abs9410），轻轻摇动使基质胶覆盖皿底，放于37℃培养箱中孵育1-2小时。实验前取出置于超净工作台或生物安全柜下室温平衡20分钟。如暂不使用，可用Parafilm封口后保存在2-8℃并于一周内使用。
• 1.2 准备2-3mL的干细胞培养基于15mL离心管中备用。
• 1.3 解冻：将冻存管迅速浸入37℃温水中，快速摇动使其在1-2分钟内解冻。注意：从液氮中取出的细胞尽量减少暴露于室温的时间。
• 1.4 离心：解冻后逐滴将冻存液加入含有干细胞培养基的15mL离心管中，平衡后以1000rpm离心3分钟。
• 1.5 重悬：离心后弃去上清，加1mL人多能干细胞培养基对沉淀进行吹吸混匀，约3-5次。
• 1.6 接种：弃去已平衡的即用型基质胶，将均匀的干细胞悬液加入预先包被的6孔板中，补全每孔2mL培养体系。
• 1.7 培养：在倒置相差显微镜下观察细胞密度与团块大小，每个团块应由4个以上细胞组成，以确保接种质量。然后放入37℃、5% CO₂恒温培养箱中培养，第二天观察细胞贴壁情况。
• 1.8 换液：从复苏开始每24小时换液一次。由于培养基中的活性成分仅够维持一天，需及时更换新鲜培养基。

2. hPSC细胞传代

• 2.1 清洗：吸去原有培养基，缓慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻摇动，沿皿边缘吸去PBS缓冲液。
• 2.2 消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干细胞消化液（abs9409），置于37℃培养箱中2-5分钟。消化时间依据细胞生长密度有所不同，通常建议时间为2-5分钟。
• 2.3 吹打：消化液吸去后，加入2mL人多能干细胞培养基，轻柔地吹打3-5次以使细胞集合脱落。\
• 2.4 离心：以1000rpm离心3分钟，弃去上清。
• 2.5 接种：用干细胞培养基轻柔吹打细胞，并将细胞悬液加入到培养板中，补全每孔2mL的培养体系。
• 2.6 换液：从传代日起每24小时换液一次，以确保细胞获得充足的营养和适宜的生长环境。

3. hPSC细胞冻存

• 3.1 清洗：同步骤2.1。
• 3.2 消化：同步骤2.2。
• 3.3 吹打：同步骤2.3。
• 3.4 离心：同步骤2.4。
• 3.5 重悬：加入2mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412），对细胞沉淀进行吹吸混匀，后移入冻存管中。
• 3.6 记录：在冻存管上标记细胞种类、时间及操作者等信息。
• 3.7 冻存：冻存管置于-80℃冰箱过夜，切忌将冻存管斜放或横放。24小时后转移至液氮中进行长期冻存。

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