### 细胞裂解液的制备

#### 一、试剂准备

1. 新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液：
- 150mM NaCl
- 1% NP-40（去垢剂）
- 0.1% SDS（去垢剂）
- 2 µg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
- 2 µg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
- 1 mM PMSF（蛋白酶抑制剂）
- 15 mM EDTA（蛋白酶抑制剂）
- 1 mM Na Vanadate（磷酸脂酶抑制剂，可选）
以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCl溶液中。

2. 在冷PBS中加入以下成分以增强细胞保护：
- 1 mM PMSF
- 15 mM EDTA
- 1 mM Na Vanadate（可选）

3. 适宜使用细胞：保持在对数期生长状态至少3-4瓶75cm²（生长面积90%以上）。

#### 二、实验步骤

1. 将含有细胞的培养瓶置于冰上，使用吸液管吸出培养液。用足量冷PBS彻底洗涤细胞，以去除残留培养基，以上操作重复2-3遍，最后一次尽量吸干剩余PBS，确保在冰上操作。

2. 加入冷的RIPA裂解缓冲液（每75cm²培养瓶加1ml），使用细胞刮刀轻轻刮取细胞。如果有多瓶同种细胞，可将第一瓶中的细胞液转移至下一瓶中继续刮取。由于裂解液较粘稠，建议使用直径稍大的吸液管。

3. 吸出刮好的细胞裂解液并转移至14ml离心管中（冷藏），然后重复步骤2以收集所有细胞。

4. 尽量将更多细胞裂解液收集到14ml离心管中，随后插入冰盒进行超声处理。超声强度应控制在不产生泡沫的状态下，每次超声2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应以10,000 rpm离心10分钟，保留上清液。

5. 取少量细胞裂解液测定蛋白浓度（使用Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计在A280处测定），分装并保存于-70℃。

### 细胞裂解方法

细胞裂解通常通过物理或化学方法实现：

**物理法**：
1. 反复冻融：将细胞置于-20℃及25-30℃环境中反复冻融10-20次，适用于大多数哺乳动物细胞。
2. 煮沸法：将细胞置于100℃沸水中煮沸5-10分钟，适用于多种微生物。
3. 超声法：利用超声破碎仪进行细胞破裂，适合大多数微生物。
4. 渗透压法：将细胞放入纯水等低渗溶液中，促使细胞吸收水分以破裂。
5. 液氮法：植物细胞一般采用液氮捻磨方式进行裂解。

**化学法**：
1. 强酸、强碱溶液：例如使用0.5N NaOH溶液可裂解大部分动物细胞和微生物细胞。
2. 生物酶：如溶菌酶、蛋白酶K等，用于分解微生物细胞。

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