细胞复苏的成功与否与冻存及复苏操作密切相关。上周，我与大家分享了细胞冻存过程中易出错的细节，详细内容请参阅《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本文将主要从复苏的角度分析，排查复苏过程中常见的问题。

复苏步骤概述

在进行细胞复苏之前，我们先回顾一下复苏的基本步骤：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，同时进行培养基复温，并将离心机设置好转速。
2. 准备一个15ml离心管，加入适量的培养基。
3. 取出冻存管，立即浸入水浴锅中，快速摇晃以确保细胞在2分钟内充分融化。
4. 将细胞悬液慢慢滴入预先加入培养基的离心管中，并以1000rpm离心3分钟。
5. 弃去上清，重悬细胞并接种至培养器皿中，最后放入培养箱中。

常见复苏错误操作

在细胞复苏过程中，以下是一些常见的错误操作：

1. 运输过程缺乏保温措施：如果液氮或冰箱距水浴锅较远，而未采取保冷措施，细胞可能在运输途中开始融化（特别是在夏季）。此时，冻存细胞应放在干冰或冰盒中运输至水浴锅。
2. 触碰冻存管：运输冻存管时，一定不要用手触碰细胞部分或将其放在口袋里。请捏住管盖或将其放在容器中以防温度升高导致细胞融化。
3. 错误的融化方式：不要使用手捂热冻存管（或进行搓热），因手心温度不够高，细胞受热不均匀，且降温速度过慢，最终导致细胞死亡。
4. 水浴时间控制不当：在水浴中未严格控制时间，直接静置而不摇晃，会降低细胞复苏的有效性。建议在2分钟内充分融化，水浴时间越长，细胞活率越低。最佳方法是捏住管盖，将管身浸入水中快速摇晃以促进细胞融化，切勿放置于水浴中静止。
5. 未完全融化：水浴结束时如果管内还有较大的冰块，未完全融化的冰块将导致细胞死亡。应特别注意，冰块中的细胞温度缓慢升高而死亡，已经融化的细胞也可能受到低温的损伤。如果您发现2分钟内很难让细胞完全融化，可以尝试将水浴锅温度提高到39度（经过验证可行），并加快摇晃速度。如果担心污染，可以将冻存管放入一次性PE手套中进行水浴。同时，注意水浴锅中的水量不能过少，确保冻存管浸入水中后能够达到设定温度。
6. 忽视去除DMSO：细胞融化后不进行离心去除DMSO。有的同学会选择在细胞融化后直接加入10倍培养基稀释，而不离心，等细胞贴壁后再更换培养基。虽然对某些易养的贴壁细胞有效，但并不适用于悬浮细胞。DMSO对细胞具有一定毒性，特别是对一些敏感细胞（如HL-60细胞等）。如果不确定自己的细胞对DMSO的敏感性，还是建议离心去除上清，以确保安全。

以上内容是基于小尚多年的经验总结而来，结合冻存篇，能够有效解决大部分复苏失败的问题。如果您还有未提及的知识点，欢迎在评论区补充。金年会金字招牌诚信至上，我们始终致力于提供最可靠的生物医疗解决方案。感谢您的关注与支持！